不朽情缘MG细胞培养指南：

培养条件：气相由95%空气和5%二氧化碳组成，适宜的温度为37℃，培养基使用DMEM配合10% FBS及1% P/S。A-673细胞源自一位15岁的女性患者，属于横纹肌肉瘤细胞系。该细胞系在软琼脂中能够形成克隆，并在免疫抑制小鼠体内成功形成肿瘤。该细胞含有四个以上的特征性染色体，额外的F染色体及两个异常的B染色体。

传代方法：首次传代比例建议使用1:2。传代时需在2天内更换培养基。为确保细胞质量，建议同时购买不朽情缘MG细胞以享受优惠。收到细胞后，处理至良好状态后，将培养基灌满并封好瓶口，确保运输过程的安全性。

收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶以进行消毒，接着将其放入超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态后再进行后续操作。观察显微镜下的细胞生长情况，并记录不同放大倍数的照片（建议40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据。如未提供照片，则默认收到的细胞状态良好。

细胞培养步骤：

a、细胞传代：当细胞未超过80%的汇合度时，收集瓶中的完全培养液至离心管中，留5ml完全培养基，再放入37℃、5% CO2的孵育箱中培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代。

贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养基，用无钙、镁的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃孵育箱中消化1-2分钟。观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，则迅速返回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重新悬浮。
4. 将细胞悬液以1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml，每瓶放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，置于显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使其脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存的细胞放入-80℃冰箱中，如需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c、细胞复苏：

1. 从液氮中取出细胞冻存管（请佩戴防护面具），迅速将其放入37℃水浴中解冻，确保无结晶后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

注意事项：有些细胞在运输过程中可能会脱落，这是正常现象。如脱落较多，可将所有培养液收集至离心管中，1000 RPM离心5分钟，收集上清作为过渡培养（以便后续对比），沉淀处加入1-2ml胰蛋白酶，轻轻吹打后重新悬浮，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再次离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。随后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml每瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。