不朽情缘MG提供了一种高效的实验方法用于平头连接，旨在将已准备好的平头载体与PCR产物直接连接。载体通常使用EcoRV或SmaI进行平头切割；而纯化后的PCR产物可以在22℃下通过DNA聚合酶I处理30分钟，充分利用该酶的外切酶活性和聚合酶活性。如果对连接的要求不是特别高，PCR产物也可以不进行处理。

如果采用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或New England Biolabs公司的VentDNA聚合酶，这两种酶都具备5’→3’校对能力，生成的PCR产物已为平头形式，可以直接进行连接。然而，平端连接的一个主要问题是其连接效率较低，即使使用大量连接酶或在反应体系中添加PEG8000，也只能有限地提高连接效率。一般情况下，PCR产物可与平端载体DNA直接连接，但效率往往不足。这是因为TaqDNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性，会在DNA链的3’末端添加多余碱基，导致PCR产物形成3'突出端的DNA分子，从而降低连接效率。为了提升连接效率，可以在大量使用T4DNA连接酶的同时，添加5-10uT4RNA连接酶。对于较短的PCR产物，使用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，结合X-gal和IPTG筛选，常能得到可观的重组子。

提高克隆效率的另一种策略是采用Klenow大片段或T4DNA聚合酶去除3'末端的突出碱基，将PCR产物转换为平端DNA，然后再依赖平端连接法进行克隆。

实验步骤

一、PCR反应

1. 依次混合以下试剂：

• H2O：35μl
• 10×PCR反应缓冲液：5μl
• 25mmol/L MgCl2：4μl
• 4种dNTP：4μl
• 上游引物（引物1）：0.5μl
• 下游引物（引物2）：0.5μl
• 模板DNA（约1ng）：0.5μl

2. 混合后离心5秒。

3. 将混合物在94℃加热5分钟后迅速降温冰冷，离心，使液滴沉至管底，然后加入TaqDNA聚合酶（0.5μl，约25U），再混匀，最后加一滴矿物油覆盖反应混合物。

4. 进行PCR循环：94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，反复循环35轮。最后一轮结束后，于72℃保温10分钟，确保反应产品充分扩增。

二、电泳分析

取10μl扩增产物，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检查反应产物的质量和长度。

三、PCR产物的纯化

扩增的PCR产物可以直接用于T-Vector克隆，但如果需要进行平头或粘性端连接，通常需先进行纯化：

1. 采用酚/氯仿法：

• 取反应产物加100μl TE缓冲液。
• 加入等体积的氯仿，混匀后使用微型离心机在10000rpm下离心15秒，提取上层水相至新管中。
• 重复氯仿提取，去除矿物油。
• 在水相中加入300μl 95%乙醇，放置-20℃下沉淀30分钟。
• 在离心机中离心10分钟，弃去上清液，加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀。
• 最后溶解沉淀于7ml ddH2O中备用。

2. 使用不朽情缘MG的Wizard PCR DNA纯化系统，可快速高效地提纯PCR产物，获得的DNA可应用于测序、标记及克隆等实验。

四、载体加dT尾

1. 将1μg的pUC19质粒用SmaⅠ全酶切。

2. 在反应中使用上述PCR反应，加入4μl的25mM dTTP。

3. 加入1μl (5U) 的TaqDNA聚合酶于72℃下反应2小时。

4. 按照酚/氯仿法进行两次提取。

5. 加入两倍体积的95%乙醇，在-20℃下沉淀1小时。

6. 离心洗涤后，真空抽干溶解在10ml ddH2O中。

五、PCR产物与载体联接

1. 在7ml PCR产物中加入1ml带dT尾的pUC质粒。

2. 加入1ml T4 DNA连接酶和1ml 10×连接缓冲液，混匀后在16℃下过夜连接。

3. 取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接

1. 在50ml PCR产物中加入0.5ml T4 DNA聚合酶混合均匀。

2. 37℃下反应10分钟后，70℃灭活10分钟。

3. 进行酚/氯仿提取两次，之后进行乙醇沉淀。

4. 质粒用SmaI切开后进行70℃灭活，取1ml（约0.1mg）加入PCR产物中，加入1ml T4 DNA连接酶和1ml连接缓冲液。

5. 取5ml连接产物转入感受态细胞，筛选重组子。

注意事项

• PCR反应液可直接用于连接，最好进行纯化以去除dNTP与ATP的竞争效果，并浓缩PCR产物。
• PCR过程非常敏感，操作尽量在无菌环境下进行。
• 使用的吸头及离心管需高压灭菌，并保证每次使用新吸头，以防相互污染。
• 加试剂前短暂离心10秒便于防止污染。
• 设置负对照以排除模板DNA外的成分。
• 纯化树脂在使用前需充分混匀。
• PCR产物中的矿物油应尽量去除，以提高DNA提取效率。

通过这些步骤和注意事项，结合不朽情缘MG的高效产品与服务，可以显著提升实验结果的可靠性与效率，适用于广泛的生物医疗研究领域。